1890年代，Emil von Behring和Kitasato Shibatasaburo首次使用“抗体”一词来定义血清中和毒素的部分。此后，这些Y形分子在免疫系统的研究中起着中心作用。它们对与其同源抗原结合的特异性和亲和力也使它们可用于诊断和治疗。如今，可通过各种修改和应用获得定制抗体。这篇综述试图全面介绍各种类型的抗体，缀合物，缀合方法，它们的优缺点和用途。

　　抗体是可溶性Y形球蛋白，响应于抗原的存在，由免疫系统的B细胞合成和分泌。具有可变区和高可变区的抗原结合位点（Fab）通常不考虑缀合，因为这会干扰表位的结合。而且，在铰链区的破坏使分子具有结合的灵活性，可能破坏抗原相互作用。因此，在制备抗体-缀合物时，必须尽可能保持Fab和铰链区不受干扰。

　　迄今为止，鉴定出的所有五类抗体-IgG，IgM，IgA，IgD和IgE已用于研究，诊断和治疗。同样，多克隆和单克隆（啮齿动物和人）抗体均已与报告系统偶联。也已经报道了与抗体片段和抗体变体的缀合。这些包括 -人骨髓瘤细胞系分泌的轻链（λ或κ）[ 1 ]。抗原结合（Fab），重链和轻链的可变区（FV），重链的可变区（Vh）和噬菌体展示表达单链可变区（scFv）。[ 2 ]人源化抗体是嵌合分子，其表达与人抗体恒定域融合的啮齿动物单克隆抗体的可变域[ 3 ]。骆驼抗体仅由重链组成，存在于骆驼/单峰骆驼和新世界骆驼科动物中，例如美洲驼和羊驼[ 4 ]。它们具有高亲和力，特异性，高热稳定性和溶解性。

　　抗体上结合的首选位点是赖氨酸的–NH 2（胺）基团或半胱氨酸的游离–SH（巯基）基团[ 5 ]。尽管缀合化学平等地对待所有可及残基，但可以缀合的分子数量受到以下限制：

　　：可以标准化仅允许特定基团反应的反应条件，以获得最佳的Ab：报告分子比例。例如，在碱性pH下，某些脂族胺基团的反应性远高于其他基团。在碱性pH下也存在总体抗体稳定性的问题。在这些条件下限制反应时间至关重要，以避免抗体变质。共轭的半胱氨酸残基在碱性pH下易于碎裂[ 6 ]。这就是为什么大多数商业偶联试剂盒设计为在15-30分钟内完成偶联反应，并且通常靶向赖氨酸的伯胺基的原因（请参见表5）。另一种选择是工程改造抗体以将pI从8-9更改为5-6 [ 7 ]。这确保了抗体在结合反应期间不会沉淀。

　　小分子（如半抗原或药物）可以以抗体：缀合物::: 1：4或什至1:10的最小比例缀合。像酶这样的较大分子的每个抗体只能被限制为两个分子。对于寡核苷酸，该比例为1：1。

　　Fab中赖氨酸和半胱氨酸残基的存在决定了Ag的结合，因此不应进行缀合。平均而言，IgG分子具有约80个赖氨酸残基，其中20个存在于溶剂可及部位。半胱氨酸残基分布更均匀，数量更少。大约16对半胱氨酸残基以12个链内和4个链间二硫键存在。链间半胱氨酸通常由于其溶剂可及性而成为偶联目标[ 8 ]。

　　减少不良结合的数量的一种方法是用硒代半胱氨酸代替半胱氨酸。这降低了在多肽链的不适当位点发生缀合的可能性，这些缀合破坏了抗体的结构（并因此破坏了其亲和力和/或特异性）[ 9 ]。

　　在抗体-药物偶联物使用转谷氨酰胺酶修饰谷氨酰胺残基的情况下，已采用无细胞系统修饰醛标记的蛋白的C末端并引入非天然氨基酸（例如对乙酰基苯丙氨酸）来产生特异性，稳定和高产的结合物[ 10 ]。

　　试剂性质好处缺点参考Traut试剂（2-亚氨基硫杂环戊烷）在pH 7.0下将伯胺转化为巯基保持正电荷保持蛋白质溶解度足够的间隔臂长度减少空间位阻不太通用[ 11 ]MBS（3-马来酰亚胺基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯）将胺改性为巯基，与其他分子形成硫醚键高度稳定的联动仅用于研究和诊断目的[ 12 ]SPDP（N-琥珀酰亚胺基3-（2-吡啶基二硫）丙酸酯）通过短链交联剂修饰游离胺基。引入的巯基部分可通过二硫键连接至半胱氨酸。可以通过跟踪在343 nm处吡啶-2-硫酮的释放来评估共轭反应。可以通过10-50 mM DTT甚至pH 8.5的SDS-PAGE样品上样缓冲液轻松裂解与半胱氨酸巯基形成的二硫键。SPDP有多种聚乙二醇化形式，允许更长的间隔臂长度。由于不溶于水，应使用高浓度的二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亚砜（DMSO）中的试剂将反应混合物中的有机溶剂保持在最低水平。[ 13 ]SATA（N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代乙酸酯）共价修饰伯胺以生成保护的巯基。添加短链（2.8埃间隔臂）试剂通过添加温和试剂（例如羟胺-HCl）进行脱酰作用，以生成游离巯基。因此，蛋白质结构/功能不受影响。可以长期保存巯基修饰的抗体。与其他含巯基的分子形成可裂解的二硫键与赖氨酸残基的伯胺形成高度稳定的酰胺键SMCC（4-（N-马来酰亚胺甲基）琥珀酰亚胺基环己烷-1-甲酸）同时包含N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯和马来酰亚胺基团。具有伯胺的NHS部分在pH 7–9下发生，形成酰胺键。试剂的马来酰亚胺部分与另一个分子在pH 6.5-7.5下的巯基反应形成稳定的硫醚键环己烷基团增强了马来酰亚胺衍生的硫醚的稳定性。这些衍生物可在0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7为4°C）中保存长达64小时。修饰的蛋白质也可以冻干并保存，以便以后与含巯基的分子缀合。形成的键是不可裂解的，SMCC是不溶于水的。因此，应使用试剂在DMF或DMSO中的高浓度溶液。[ 14 ]磺基SMCC还同时包含N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯和马来酰亚胺基团。具有伯胺的NHS部分在pH 7–9下发生，形成酰胺键。试剂的马来酰亚胺部分与另一个分子在pH 6.5-7.5下的巯基反应形成稳定的硫醚键由于试剂是水溶性的，因此可以在生理溶液中进行交联反应。不存在有机溶剂也可以确保蛋白质结构不被扰动，就像SMCC一样，环己烷桥可以赋予马来酰亚胺衍生物以稳定性，最高可以储存在0.1M磷酸钠缓冲液中（pH 7在4C下）64小时缀合物通过不可裂解的键结合。由于不透膜，因此不能用于细胞和组织的原位交联[ 15 ]

　　巯基的一个优点是它们可用于形成稳定的，可裂解的二硫键（-SS-）。抗体中的大多数半胱氨酸已经以二硫化物的形式存在，可用的半胱氨酸可能不在方便的位置。因此，可以通过用Trauts试剂（2-亚氨基硫杂环戊烷），MBS，SPDP，SATA及其衍生物等试剂进行修饰，将巯基引入伯胺的位置，尤其是赖氨酸残基的位置。表1列出了这些试剂的某些功能。

　　图1.将胺改性为巯基。A）与Traut试剂反应生成游离巯基。B）使用SMCC产生不可裂解的巯基。C）使用马来酰亚胺交联产生保护的巯基。

　　与抗体连接的酶构成酶联免疫吸附测定（ELISA）的基础（请参见表2）。这些是IA中使用最广泛的类型之一，并且比RIA更安全，更容易。它们将抗体-抗原相互作用的特异性与酶测定的灵敏度结合在一起。此外，由于可以在多个孔板中进行，因此可以同时分析多个样品。迄今为止，已基于所使用的底物开发了三种主要类型的ELISA。最早的是使用比色法进行检测的免疫分析法。但是，此方法通常会检测到0.01 ng至0.1 ng相对较低的抗原。使用荧光底物和化学发光底物可以提高ELISA的灵敏度。

　　酵素反应部分结合方法好处缺点辣根过氧化物酶糖高碘酸法可量化的结果不能用于整个电池尿素酶胺类戊二醛由于没有内源性脲酶活性，因此可用于全细胞交联的特异性可能不确定碱性磷酸酶胺类NHS，马来酰亚胺-硫醇偶联可量化的结果不能用于整个电池β-半乳糖苷酶胺类4-（N-马来酰亚胺基甲基）-环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯（磺基SMCC）可用于细胞ELISA实验结果反映了较高系统的真正Ab-Ag反应，因为没有固有的β-gal活性

　　酶与抗体的缀合可以基于酶中糖或赖氨酸基团的连接。糖蛋白上存在的糖的高碘酸钠氧化使其易于与抗体中赖氨酸残基的末端胺（–NH 2）反应。这在糖蛋白和抗体之间形成稳定的共价连接。这是将诸如辣根过氧化物酶（HRP）之类的酶与抗体偶联的选择方法[ 16 ]。

　　脲酶与抗体的缀合已经通过简单的戊二醛交联完成。戊二醛，如己二酸二甲酯和同源的亚磺酸二甲酯，是同双功能交联剂[ 17 ]。这些分子的两端均具有相同的活性基团，并且具有足够长的“连接基”。这些通常用于蛋白质-蛋白质交联，因此用于抗体-酶结合。活性端基针对两种蛋白质上的赖氨酸和羟基赖氨酸的末端胺（-NH 2）。

　　使用这些交联剂的优点是易于进行反应。将待交联的蛋白质与试剂在合适的无胺缓冲液中温育，然后通过柱色谱法分离高分子量蛋白质。明显的缺点是非特异联导致形成不符合目的的大蛋白聚集体。

　　脲酶结合物已用于研究[ 18 ]和一些肝炎[ 19 ]和梅毒[ 20 ]的诊断测试。脲酶活性的检测方法包括在溴甲酚紫存在下随着氨的析出从到紫色的比色过渡。这对于确定经验值很有用。但是，可以使用结合了β-半乳糖苷酶的抗体对结果进行定量，这对于动物细胞也具有较低的背景[ 21 ]。现在，细胞ELISA（流式细胞术标记细胞的前体）更喜欢将β-半乳糖苷酶结合的抗体用于尿素酶结合的抗体。

　　这些结合物可用于ELISA，Western印迹/斑点印迹，免疫组织化学（IHC），最近还针对实体瘤[ 22 ]。

　　荧光染料具有吸收一个波长的电磁辐射，然后以更长的波长发射该波长的特性。斯托克位移对于检测少量目标化合物/代谢物/蛋白质至关重要。

　　荧光标记的抗体赋予结合特异性，可用于定位。在荧光标记中，连接至荧光团核心的琥珀酰亚胺酯官能团靶向抗体上的伯胺，形成稳定的共价键[ 23 ]。抗体的标记程度取决于游离的伯胺基团的数目以及荧光团是否在空间上影响结合的特异性，亲和力或亲和力。由于可以连接到抗体的荧光团数量是有限的，因此没有可以与该偶联抗体家族相关的标准。简而言之，荧光染料标记的抗体的问题是荧光团太少或过多，非特异性染色以及抗体-抗原特异性或亲和力丧失[ 24]]。这就是为什么荧光团标记的抗体更多地用于免疫组化和FACS，而不是用于定量免疫测定。表3给出了已经与抗体缀合的天然荧光染料。

　　大多数其他商业染料，包括Alexa染料，德克萨斯红，都源自这些染料。表4列出了荧光染料及其发射波长。

　　商业试剂盒提供具有异硫氰酸酯修饰的荧光染料。这些染料可以使用“活化”试剂在一个步骤中偶联到胺基上，该试剂通常是琥珀酰亚胺基4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酸酯（SMCC）。在高pH（通常为9.0）下，将SMCC在二甲基甲酰胺中的高浓度溶液与异硫氰酸酯修饰的荧光团一起孵育。这会修饰抗体，并使其准备好与荧光标签偶联。添加标签，在室温下孵育一个小时。然后，淬灭剂将未使用的荧光探针清除掉。建议通过HPLC纯化标记的抗体以去除未结合的探针。例如，Dong JX等人使用Thermo Fisher的琥珀酰亚胺基Alexa 647将抗Homer1纳米抗体与Alexa 647偶联（A20186）[25 ]。

　　荧光染料标记的抗体的显着缺点是样品中可能存在的高背景散射（噪声）和来自生物分子的非特异性荧光。这些会干扰测量并限制此类探头的使用。在这种条件下，镧系元素缀合的抗体具有理想的荧光团，它们具有长的斯托克斯位移（Stokesshift），并能保持毫秒级的兴奋性[ 26 ]。Han G等人发表了三种结合镧系元素和其他稀土元素的抗体方案[ 27]。对于大规模流式细胞术，Fluidigm Corporation提供了用于偶联抗体的试剂盒。Rosshart SP等人使用了Fluidigm Corporation的Maxpar®抗体偶联试剂盒来研究野生小鼠出生的实验室小鼠的微生物群和免疫反应[ 28 ]。

　　镧系元素（有时称为稀土元素）是元素周期表中从原子序数57（镧）到71（（）的14个“ f嵌段”元素的集合。其。