糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见、最严重的并发症之一，目前缺乏有效的治疗方法。丹参是治疗DN的关键中药之一。丹酚酸B和丹参酮IIA是丹参中含量高并且结构明确的两种单体活性成分，可有效改善早期DN。本研究评价丹酚酸B和丹参酮IIA对早期DN大鼠的配伍作用，并阐明其作用机制。本研究采用链脲佐菌素（STZ）联合高糖高脂饮食诱导早期DN大鼠，丹酚酸B、丹参酮IIA及其组合对其进行干预。我们对肾、肝的病理切片及生化指标进行分析；采用网络药理学方法预测其可能的作用机制；通过代谢组学、酶联免疫法和蛋白质印迹阐明了其机制。根据我们的分析，丹酚酸B和丹参酮IIA可以协同调节24 h尿蛋白(UTP)、尿素和肌酐(Scr)，并改善早期DN大鼠的肾损伤。早期DN大鼠的代谢异常通过调节饱和脂肪酸的生物合成、磷脂代谢、类固醇生物合成、丙氨酸和花生四烯酸得到改善。丹酚酸B与丹参酮IIA以13.4:1的质量比联合使用，可显著减轻肾脏炎症，上调p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt，下调p-NF-κB/NF-κB，优于单用组，可被PI3KLY294002逆转。丹酚酸B和丹参酮IIA可协同改善早期DN大鼠的糖脂紊乱、肝肾损伤和抵抗肾脏炎症，其机制可能与调节PI3K/Akt/NF-κB信号通路有关。

　　译名：丹酚酸B和丹参酮IIA 通过调节PI3K/Akt/NF-κB信号通路协同改善早期糖尿病肾病

　　成功建模后，大鼠逐渐出现皮毛发黄、精神状态不佳、逐渐死亡，并伴有明显的多饮、多食、多尿，体重显著减轻，FBG显著升高（图1A）。共有41只大鼠死亡，死亡率为37.27%。与对照组相比，模型组的最终FBG显著增加，最终体重显著降低（P0.001），表明糖尿病大鼠成功建立。与模型组相比，不同给药组对FBG有不同程度的调节作用。阳性药（PD）组、丹酚酸B（SB）组、丹参酮IIA（TA1）组、低剂量组合1（Comb1L）组、高剂量组合1加LY294002（Comb1+LY）组和高剂量组合1（Comb1H）组均有显著的缓解作用（P0.05）。器官指数结果（图1B）显示，与对照组相比，模型组的心、肝、肾、肺指标显著升高（P0.05）。与模型组相比， TA1、低剂量组合2（Comb2L）、高剂量组合2（Comb2H）和高剂量组合2+LY294002（Comb2+LY）组具有显著的回调效应（P0.05）。

　　图2 各组大鼠的三酯（TG）、总胆固醇（TCH）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白、24小时尿蛋白（UTP）、尿素氮（尿素）、血清肌酐（Scr）和尿肌酐（UCR）。（n≥6，平均值±标准差。#P0.05，###P0.01，###P0.001：模型组与正常组比较；*P0.05，**P0.01，***P0.001：模型组与给药组比较）。

　　如图2所示，与对照组相比，模型组TG、TCH、UTP、尿素和Scr显著升高（P0.05），HDL和Ucr显著降低（P＜0.05），说明DN模型建立成功。SB和TA1中24 h UTP的下调与模型组比较有显著性差异（P＜0.05），而在Comb1L和Comb1H中更为显著（P＜0.001）。与模型组相比，SB和TA1中尿素和Scr的下调不显著（P0.05），而Comb1L中尿素和Scr的下调显著（P0.05）。SB和TA1对尿素和Scr的调节与模型组比较无显著性差异（P0.05），Comb1L组有显著性差异（P＜0.05）。与模型组相比，SB中的尿素和HDL以及TA1中的HDL的调节不显著（P0.05），而Comb2L中的调节显著（P0.05）。

　　图3 大鼠肾脏组织病理切片（×200，HE染色）。（箭头：嗜酸性液滴出现在肾小管的管腔中，橙色箭头：管状扩张/上皮扁平化/不规则管腔，绿色箭头：肾小球血管充血/间质毛细血管充血，黑色箭头：肾包膜扩张）。

　　如图3所示，肾小管管腔内的嗜酸性粒细胞液滴、肾小管扩张、管腔不规则、上皮细胞扁平化以及间质血管和毛细血管外渗在模型组肾脏中更为常见，这表明早期DN大鼠模型的成功。所有给药组均有不同程度的缓解，其中PD、Comb1L和Comb1H组的病理变化相对较少。

　　图4 （A）丹酚酸B和丹参酮IIA靶点和早期DN靶点的维恩图；（B）丹酚酸B和丹参酮IIA治疗早期DN的潜在靶点的相互作用网络（圆圈表示基因，程度越大，圆圈越大，颜色越深（红色）；组合得分越大，线条越粗，颜色越浅（蓝色））；（C）丹酚酸B治疗早期DN的GO和KEGG靶点富集分析（前20名）；（D）丹参酮IIA治疗早期DN的GO和KEGG靶点富集分析（前20位）。

　　GeneCards和OMIM数据库共确定了3475个与早期DN相关的靶点。我们通过SwissStarget平台分别鉴定了98个与丹酚酸B和和111个与丹参酮IIA相关的靶点。丹酚酸B和早期DN共有61个共同靶点，丹参酮IIA和早期DN有50个共同靶点（图4A）。

　　STRING数据库的结果显示，丹酚酸B和早期DN的PPI网络图共有61个节点和311条边，丹参酮IIA和早期DN共有50个节点和208条边。Cytoscape 3.6.0软件用于绘制共同靶点的相互作用网络，如图4B所示。筛选程度≥20的靶点，如表S1所示。表皮生长因子受体（EGFR）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、AKT等蛋白相互作用频率高，靶位点间相互作用强，程度高，尤其是EGFR基因，提示这些靶点可能是丹酚酸B和丹参酮IIA治疗早期DN的潜在核心靶点。

　　我们通过GO和KEGG富集分析分析丹酚酸B和早期DN的共同靶点（图4C），获得了140个生物过程（BP），主要与脂蛋白代谢、低密度脂蛋白颗粒受体生物合成过程和血小板衍生生长因子受体信号转导途径有关。结果共获得37种细胞成分，主要与丝氨酸肽酶复合物和质膜有关；获得了50个分子功能（MF），主要与C-X3-C趋化因子结合外肽酶活性、半胱氨酸型内肽酶活性等功能有关，如图4所示。KEGG富集获得55条信号通路，主要涵盖ECM受体相互作用和PI3K-Akt信号通路。

　　我们通过GO和KEGG富集分析分析丹参酮IIA和早期DN的共同靶点（图4D），获得140个生物过程（BP），主要与突触传递的负调控和造血干细胞迁移的正调控有关；共获得31个CC，主要与E1-CDK2复合体、核包膜腔、非对称性突触等有关；获得39个MF，主要与食欲素受体活性、乙酰胆碱酯酶活性和胆碱酯酶活性有关。KEGG富集得到35条信号通路，主要包括Rap1信号通路、FoxO信号通路和PI3K-Akt信号通路。

　　丹酚酸B和丹参酮IIA信号通路的交叉揭示了36种共同通路，包括PI3K-Akt信号通路，如表2所示。

　　图6 C组（绿色）和M组（蓝色）偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）的得分图（A：血清，C：尿液）；C组和M组的S图分析得分图（B：血清；D：尿液）。

　　与对照组相比，早期DN大鼠血清中不饱和脂肪酸的生物合成途径、磷脂代谢、类固醇生物合成、类固醇激素生物合成和花生四烯酸代谢，尿液中的花生四烯酸代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成和其他代谢途径发生了改变（图8A和C）。丹酚酸B、丹参酮IIA及其组合可调节早期DN大鼠血清中不饱和脂肪酸的生物合成、磷脂代谢、类固醇生物合成和花生四烯酸代谢，以及尿液中的泛酸、辅酶a生物合成、β-丙氨酸代谢、半乳糖代谢、不饱和脂肪酸生物合成和嘌呤代谢代谢、酪氨酸代谢、、花生四烯酸代谢、丙氨酸，谷氨酸和天冬氨酸代谢、苯丙氨。