药物剂量和组合是影响多效中药疗效的主要因素。黄连（Coptis chinensis Franch，CF）是一种具有多重功效的代表性中药，常与吴茱萸（Tetradium ruticarpum (A. Jussieu) T. G. Hartley，TR）合用治疗胆汁淤积。本研究评估了CF剂量及其与TR联用对CF治疗胆汁淤积症疗效的影响，包括对粪便代谢和粪便微生物的影响。本研究对α-萘异硫氰酸酯（ANIT，50 毫克/千克）诱导胆汁淤积的大鼠分别给予低剂量（0.3 克/千克）和高剂量（0.6 克/千克）CF，以及分别以0.6克/千克和0.9克/千克的剂量给予CF和TR；通过测定这些处理的抗炎、降脂和抗氧化应激特性，评估了它们的抗胆汁淤积作用；此外，还对粪便代谢组学和粪便微生物进行了分析。结果显示低剂量CF的降血脂作用比高剂量CF更强，而高浓度CF的抗炎和抗氧化应激作用更强。与TR合用可增强CF的降脂作用，但拮抗CF的抗炎作用。对粪便代谢组学和粪便微生物的分析表明，不同剂量的CF以及不同剂量的CF与TR合用时，对脂质和氨基酸代谢相关途径（包括亚油酸、酪氨酸和花生四烯酸代谢途径以及氨基酸生物合成）的调节存在差异。这些差异可能会导致这些制剂的抗胆汁淤积效果不同。CF的剂量会影响其抗胆汁淤积的疗效。与TR合用会对CF的特性产生协同或拮抗作用，这可能是通过改变粪便代谢和粪便微生物平衡来实现的。

　　各组中观察到的药用植物活性代谢物见图2。低剂量黄连（CF_L）组和高剂量黄连（CF_H）组的主要活性代谢物是小檗碱、黄豆黄素和花生四烯酸，而CT_L组和CT_H组的主要活性代谢物是这三种代谢物以及吴茱萸碱、儿茶酸、异鼠李素、黄柏酮和槲皮素（表3）。

　　低剂量和高剂量的CF以及它们与TR的组合都具有显著的抗胆汁淤积活性、疗效与熊去氧胆酸（UDCA）相似（图3A-G）。病理组织学检查显示，各组植物药都能减轻ANIT引起的炎症和肝细胞坏死（图 3H-O）。综上所述，这些研究结果表明，CF 和CT对胆汁淤积症有显著疗效。

　　CF_L能明显降低胆汁淤积大鼠肝组织中炎症因子IL-1β和IL-6的浓度，显示出一定的抗炎功效、而CF_H则明显降低了IL-1β、TNF-α、IL-6的浓度，增加了IL-10（图 4）。CF具有明显的抗炎作用，高CF剂量比低CF剂量更明显，这表明CF剂量与抗炎活性之间存在定量关系。然而，添加TR并没有增强低剂量和高剂量CF的抗炎作用。有趣的是，在降低IL-6和增加IL-10浓度方面，CT_H的效果不如CF_L，这表明这两种药物在治疗胆汁淤积症方面的抗炎作用存在拮抗作用。

　　图3 肝功能检测。血清生化指标：（A）丙氨酸转氨酶（ALT），（B）天冬氨酸转氨酶（AST），（C）碱性磷酸酶（ALP），（D）γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT），（E）直接胆红素（DBIL），（F）总胆红素（TBIL），（G）总胆汁酸（TBA），（H）肝脏炎症和坏死评分，n = 6，***/**/*，p 0.001/p 0.01/p 0.05，ns，无显著性意义。(I-O)组织病理学检查，100x和200x。

　　通过测量血清和肝脏样本中的脂质水平，确定给药处理对脂质代谢的影响；使用自动生化分析仪检测各组大鼠血清中的脂质相关指数（图 5A-D）。肝组织的油红 O 染色评估了脂肪变性（图 5E）。结果表明，CF 或 CT 均能显著减少胆汁淤积大鼠肝组织中脂滴的积聚，改善脂质代谢紊乱。CT_L的降脂效果明显优于CF_L、这表明CF和TR在治疗胆汁淤积症方面具有协同降脂作用。

　　通过测量这些大鼠血清中谷胱甘肽（GSH）、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）的浓度，我们确定了治疗的抗氧化应激效果（图6）。CF_L没有显示出明显的抗氧化应激作用，而CF_H则具有非常明显的抗氧化作用，这可能是因为只有高剂量的CF才具有抗氧化应激的功效。然而，添加TR并没有明显增强CF的抗氧化作用。

　　我们通过无监督主成分分析（PCA）初步确定了样品的总体分布和整个分析过程的稳定性（图 7B-F）；随后，采用有监督的正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）来区分各组间代谢谱的总体差异，并确定这些组中差异表达的代谢物（图7G-J）。为防止模型过拟合，我们对模型的质量进行了7次交互验证和200次响应置换检验（图7K-N）、模型参数见图7A。以上分析显示，CF_H与CF_L、CT_L与CF_L、CT_H与CF_H组之间存在显著的代谢差异。

　　通过单维和分析，我们筛选出各组间差异表达的代谢物。在OPLS-DA分析中，我们使用变量投影重要性（VIP）来衡量代谢物表达模式对各组样本分类判别的影响强度，并筛选代谢物的显著差异。组间差异代谢物水平的显著差异通过t检验进行验证。筛选标准为VIP 1，P 0.05，火山图（图 8A-D）显示了组间比较中差异代谢物的表达趋势和数量。模型组和对照组的比较显示，前者有617种代谢物下调，479种代谢物上调。对CF_H组和CF_L组的比较发现，前者有222种代谢物下调，后者有184种代谢物上调。此外，比较CT_L组和CF_L组发现，前者有255种代谢物下调，后者有307种代谢物上调、而CT_H组和CF_H组的比较则发现前者有269种代谢物下调，后者有288种代谢物上调。组间比较的聚类统计分析筛选出了前50种差异表达的代谢物（图8E-H）。不同剂量的CF以及与TR联合使用对胆汁淤积症的治疗效果不同，可能与这些代谢物的不同表达有关。

　　出现差异表达的代谢物可能是由于不同剂量的CF及其与TR的组合具有不同的抗胆汁淤积功效。对这些差异表达的代谢物进行通路富集分析，可能会揭示这些抗胆汁淤积代谢通路差异的机制。KEGG富集分析在模型组和对照组（图 8I）以及CF_H组和CF_L组的比较中发现了重叠的通路。这些途径包括涉及 ABC 转运体、类固醇生物合成以及亚油酸、花生四烯酸和酪氨酸代谢的途径（图 8J）。这些途径可能是高剂量和低剂量CF在抗炎、降血脂和抗氧化应激效应方面存在差异的原因。研究发现，CT_L和CF_L治疗胆汁淤积疗效的差异与不饱和脂肪酸的生物合成、ABC 转运体和CAMP信号通路的差异有关。CT_H和CF_H的疗效差异与亚油酸代谢的调节有关（图8K、L）。

　　图8 差异代谢物筛选和功能富集分析。(A-D）大鼠粪便代谢物的火山图、(E-H）大鼠粪便代谢物聚类热图、(I-L）差异代谢物KEGG富集分析。

　　根据扩增子序列变异（ASV）聚类分析的结果，我们分析了大鼠组有和特有的ASV数量，并绘制成花瓣图（图9A）。对照组、模型组、CF_L组、CF_H组、CT_L组和CT_H组共有三个ASVs。图9B总结了每个样本在不同分类水平上的相对丰度，包括门、纲、目、科、属和种。

　　样本测序量的合理性通过alpha多样性分析进行评估，该评估包括取样量是否充足以及每个样本中物种的丰度和均匀性（图9C-E）。通过beta多样性分析，包括PCoA和NMDS分。