体外表达蛋白在很多分子生物学研究中具有举足轻重的地位，重组蛋白表达纯化是分子生物学传统技术，经过几十年的发展已经非常成熟，但这也是一个很依赖经验的技术，特别是在遇到问题的时候知道从哪些方面去着手解决非常考验从业经验，对新手来说也有很多需要注意的细节是决定能否拿到目的蛋白的关键。

　　重组蛋白表达分多个体系，比如大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物表达系统及新兴的无细胞表达技术，可选择的技术路线较多，在经费、时间、难易程度等考量下选择适合自己研究目的的表达体系最重要。

　　重组蛋白表达纯化理论上很简单，无非是中心法则的运用，但在实际操作过程中也会遇到各种形形色色的问题，导致最后表达或者纯化失败，我们收集了一些比较常见的实验中遇到的问题及难点，欢迎大家一起讨论。

　　选择合适的技术路线会让整个实验过程事半功倍，少走弯路，一般来说要遵循几个基本的原则：最根本的一点是要能满足实验需求，例如研究一个人源蛋白，对其活性或者翻译后修饰要求很高，那就首选哺乳动物表达系统，或者只需要简单 Western Blot 验证，那大肠表达就能满足需求；二是经济性及时效性，一般来说大肠表达最快、成本也最低，哺乳动物表达成本较高，时间也较长；三是技术熟练度及其他需要考虑的问题。

　　设计问题常出现在新手中，常见的几个问题如信号肽未去除、密码子位移等。成熟蛋白一般是不带信号肽的，大肠杆菌本身也缺乏处理信号肽的机制，信号肽本身一般也具有较强的疏水性，带信号肽表达会导致蛋白无活性或大量包涵体等问题，所以一般在原核表达时候会去除信号肽；密码子移码主要容易在选择酶切位点时候出现，比如常见的 Nco I 位点。另外比如稀有密码子可通密码子优化解决，在蛋白不表达的时候可以尝试优化一下密码子；序列 GC 含量、蛋白大小等问题都是在设计时候需要考虑到的问题；纯化标签的选择，促溶标签对后续研究是否有干扰等也需要全面考虑。

　　蛋白不表达原因很多，大部分情况下可以从下面的几个方面去调整排除。通常来说原核表达中小于 10kd、大于 100kd 的蛋白是比较难表达的；质粒构建好后一定要通过测序确认，仔细比对载体序列及插入序列，确保没有移码及突变；检查表达菌株与质粒是否配套，比如Novagen 的 pet 系列载体是 T7 启动子，配套常用 BL21 及其衍生菌株，Qiagen 的 pQE 系列载体使用的是 T5 启动子，需要用到 M15 等配套菌株做表达；检查表达条件是否合适，比如诱导型表达是用诱导剂还是温度诱导，是否是组成型表达等；培养基的选择，LB 培养基中不表达，换用富营养的 TB 培养基可能会解决这个问题；也有可能是蛋白表达量太低或者是降解快，必要时需要通过 Western Blot 来确认。

　　包涵体在原核中及其常见，通常来说是因为蛋白不正确折叠形成的，原因很多，可能表达过快而来不及折叠，也可能是缺少翻译后修饰导致不正确折叠，还可能是蛋白本身疏水性强等各种原因，可以通过降低诱导温度及诱导剂浓度、引入分子伴侣共表达、换专用感受态等方式来解决，或者包涵体纯化后复性，注意包涵体纯化复性一般是 his 标签蛋白，常用变性剂为尿素和盐酸胍，其他纯化标签需要注意是否兼容变性剂。包涵体纯化后的复性是一个世界性难题，并没有一个通用解决方案，常用的复性手段有稀释复性、透析复性、分子筛及离子柱层析等，复性遵循原则：低温、低浓度、小梯度，添加剂如 PEG8000、精氨酸等在复性中也常用到，可在一定程度上提高复性成功率。

　　降解也是纯化中常见的现象，一般是因为细菌本身的蛋白酶引起的，在破胞及后续的操作中保持低温及全程添加蛋白酶能一定程度上解决降解问题；buffer 中加 5-10%也能起到抑制降解的作用；检查蛋白序列，可参考 pET 手册中的 N 端原则，如果 M 后为精氨酸 、赖氨酸、 组氨酸 、苯丙氨酸 、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或色氨酸等的话可能对蛋白稳定性影响较大，尽量避免；也可能是表达提前终止，或者因为密码子偏好性问题，可换用其他感受态如 Rosett、OrigamiB 等尝试；如果真核蛋白翻译后修饰对蛋白稳定性有影响的话需要考虑换用线

　　纯化过程中洗杂并不是每次都能很完美洗去杂蛋白，特别是Ni 柱纯化的蛋白，通常杂蛋白较多，需要多种纯化方式联用，比如离子交换、疏水作用纯化、分子筛等。原核表达纯化蛋白时候很多时候分子伴侣会跟目的蛋白一起很难分离，可通过离子柱来结合分子伴侣蛋白而让目的蛋白直接流过柱子来分离，也可尝试 Ni 亲和层析时候用高盐 buffer（eg：2M NaCl），很多时候也能达到目的；也可更换表达感受态，降低表达背景，如 plysS 菌株；

　　也能有效提高纯化纯度，并且很大程度上可以减少工作量，例如先用 his 标签亲和层析，再用 flag 标签做二次纯化，因 flag 特异性很强，二次纯化能明显提高蛋白纯度，但因其成本较高，flag 等标签在大规模纯化中不常用。

　　由于蛋白表达后存在多种状态，电荷分布可能有差异，导致迁移速率有变化，会导致 SDS-PAGE 条带偏移，复性后蛋白与变性蛋白比较容易出现大小偏移现象，不同的翻译后修饰也会导致条带大小不一样，比如 Tau 蛋白存在多种异构体，同时具有较为复杂的磷酸化、泛素化、糖基化等等翻译后修饰，所以可能会出现多条条带现像（eg：30-80 kDa），原核表达的 tau 与磷酸化 tau蛋白大小就有明显差异，必要时候可通过 WB 验证。

　　以上只讨论了体外表达中所遇到的一小部分问题，研究过程中遇到问题时需要大量排查、试错工作，特别是在面对一个全新蛋白的时候，细心才是成功的关键。