细胞膜包被纳米颗粒（Cell Membrane-Coated Nanoparticles，CNPs）是一种将合成纳米颗粒核心包覆在天然细胞膜上的纳米颗粒，它们表现出多种表面标记，使它们能够模拟天然细胞相互作用，并用于各种生物医学应用。这些应用包括诊断、治疗和预防疾病。

　　研究人员通过不同方法对CNPs进行功能增强，包括脂质插入、化学共轭、代谢工程和遗传工程。遗传工程被认为是引入新蛋白质以增强纳米颗粒功能的一种强大和灵活的方法，包括用于免疫调节、疾病靶向和细胞内逃脱等。然而，将可溶性蛋白质遗传工程到细胞膜上相对复杂，通常需要将配体与另一蛋白质的跨膜结构域融合，这些融合蛋白质需要根据具体情况进行优化，可能会出现蛋白质错误折叠、空间位阻以及低表达水平等问题。

　　2023年10月30日，加州大学圣地亚哥分校通讯作者张良方院士和Ronnie H. Fang，介绍了一种基于遗传工程的模块化方法，用于功能化CNPs，该方法可以将各种配体结合到纳米颗粒表面。具体来说，通过工程技术，CNPs表面被改造以表达SpyCatcher膜锚，这个膜锚可以与携带SpyTag的任何分子形成共价键。研究人员使用这种方法成功地制备了三种不同类别的靶向CNP制剂，包括设计的蛋白质重复（designed ankyrin repeat protein）、afbody以及单链变量片段（single-chain variable fragment）等不同的靶向配体。在体外实验中，这些经过修改的纳米颗粒表现出更强的亲和力，对过表达相应受体的细胞系具有更好的靶向性。此外，当这些功能化的纳米颗粒与化疗药物一起制备成药物载体时，它们在卵巢癌小鼠移植瘤模型中表现出强大的靶向能力和抑制肿瘤生长的效果。该论文研究成果以“A modular approach to enhancing cell membrane-coated nanoparticle functionality using genetic engineering”为题，发表在Nature Nanotechnology期刊上。共同第一作者是加州大学圣地亚哥分校的Nishta Krishnan和Yao Jiang。

　　首先，研究人员通过病毒转导工程了野生型HEK293细胞表面，使其表达SpyCatcher。为了锚定这个蛋白质，他们使用了转铁蛋白跨膜结构域，并将其与超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）融合作为报告基因。通过流式细胞术，筛选出表达高密度SpyCatcher的工程细胞，然后进行单克隆选择，建立了稳定的细胞系，命名为HEK293-SC。

　　接下来，研究人员将可溶性配体与SpyTag进行修饰，包括荧光蛋白mKate2、针对mCherry的设计的蛋白重复（DARPin，命名为αmCherry）、针对表皮生长因子受体（EGFR）的affibody（命名为αEGFR）和针对人表皮生长因子受体2（HER2）的单链变量片段（scFv，命名为αHER2）。每个构建的质粒被引入到适当的细菌或哺乳动物表达系统中，然后通过镍-亚硝基三乙酸柱层析法分离出每个带有附加的组氨酸标签（His-tag）的SpyTag标记的蛋白质。

　　在成功制备了SpyTag标记的配体后，研究人员评估了它们与SpyCatcher的结合能力以及它们与相应细胞表面受体的靶向能力。他们发现SpyTag标记的蛋白与HEK293-SC细胞的结合呈剂量依赖性，流式细胞术显示了细胞表面的强烈mKate2荧光信号。类似的剂量依赖性结合也观察到其他融合蛋白。此外，每个SpyTag标记的配体与其相应的受体的细胞共培养后，显示了与受体的结合，具体地，αmCherry与HEK293T-mCherry细胞结合，而不与野生型HEK293T细胞结合；αEGFR和αHER2分别与SKOV3细胞结合，但不与MDA-MB-453和MDA-MB-231细胞结合。为了验证靶向的特异性，每个SpyTag标记的配体与既具有相应受体又不具有相应受体的细胞异质群体一起培养，结果显示配体几乎只结合到了适当的靶细胞。

　　首先，作者成功确认了所有工程配体的功能性。然后，他们演示了如何将HEK293-SC细胞的细胞膜分离并涂覆在聚（乳酸-共-聚乙二醇酸）（PLGA）纳米颗粒核心表面，从而获得基础的SpyCatcher功能化纳米颗粒（SC-NPs）。SC-NP的合成经过了优化，通过改变膜与PLGA核心的比例，以确保合适的膜覆盖，以防止纳米颗粒在磷酸缓冲盐水（PBS）中因电荷屏蔽而聚集。他们还使用生物素化的PLGA核心来确认涂覆的完整性。SC-NPs的大小约为120纳米，略大于PLGA核心，表面ζ电位与HEK293-SC细胞膜囊泡相似，进一步表明成功的膜覆盖。此外，SC-NPs的ζ电位与涂覆有野生型HEK293细胞膜的纳米颗粒相似，表明引入SpyCatcher不会对表面电荷产生影响。

　　作者选择ST-mKate2来初步展示SC-NPs的模块化功能化。为了合成mKate2共轭的纳米颗粒（mKate2-NPs），SC-NPs与可溶性蛋白一起孵育，然后使用分子排除色谱法进行纯化。纳米颗粒的大小略微增加，而ζ电位保持相似。实验结果表明，通过使用SpyTag和SpyCatcher，可以成功实现CNPs的模块化功能化，将特定的配体固定到纳米颗粒表面，并保持其稳定性。

　　研究人员使用经过模块化功能化的纳米颗粒（CNPs），分别用ST-αmCherry、ST-αEGFR和ST-αHER2进行孵育，生成了相应的靶向纳米颗粒（αmCherry-NPs、αEGFR-NPs和αHER2-NPs），然后将它们与表达相应受体的癌细胞共孵育。实验结果表明，这些模块化功能化的纳米颗粒具有很高的靶向特异性。作者在共培养实验中验证了靶向特异性，即将模块化功能化的纳米颗粒与同时具有相应受体阳性和阴性的细胞混合培养，结果显示每种纳米颗粒都更倾向于与适当的靶向细胞结合。

　　为了评估模块化CNP配方用于癌症治疗的潜力，研究人员选择了多西紫杉醇（DTX）作为模型化疗药物，并将其封装到自组装的PLGA核心中。结果显示，αmCherry-[DTX]NPs对HEK293T-mCherry细胞具有高效的细胞毒性，而αEGFR-[DTX]NPs和αHER2-[DTX]NPs对SKOV3细胞也具有高毒性。

　　研究人员使用裸小鼠植入SKOV3细胞的皮下移植瘤模型来评估这些模块化功能化的CNPs的性能。荧光标记的αEGFR-NPs或αHER2-NPs经尾静脉注射后，通过成像观察小鼠体内情况。对于这两种有针对性的纳米颗粒，1小时内在肿瘤部位观察到强烈的荧光信号，随后随时间略微减弱。相比之下，未靶向的SC-NP配方几乎没有观察到靶向效应。

　　通过使用装载DTX的纳米颗粒来评估治疗效果。一旦肿瘤大小达到平均70 mm2时，纳米颗粒以每隔3天1次的方式进行静脉注射，每次给药剂量为每千克体重3毫克，总共四次给药。结果显示，αEGFR-[DTX]NPs和αHER2-[DTX]NPs能够控制肿瘤生长，而SC-[DTX]NPs的影响较小。

　　在治疗过程中，药物加载的纳米颗粒对小鼠的体重没有明显影响，表明它们具有良好的安全性和潜在的减少剂量的可能性。进一步评估了耐受性和潜在的非靶向副作用，对于免疫活跃小鼠，SC-NPs、SC-[DTX]NPs、αEGFR-[DTX]NPs和αHER2-[DTX]NPs在与疗效研究相同的时间表上进行了给药，然后在第一次注射后1天和10天进行了样品采集进行分析。血液化学面板显示，接受药物加载纳米颗粒的小鼠的所有参数与对照组小鼠一致，包括红细胞、血小板和白细胞数量。

　　总之，研究团队成功开发了一种可模块化地修改的细胞膜包裹纳米颗粒（CNP）平台。他们利用SpyCatcher-SpyTag结合对，可以在接触时自发形成共价异肽键，将多种成分附着到纳米颗粒表面，引入了新的功能。研究中使用了多种类型的配体，包括荧光蛋白和三种不同的靶向分子。这些模块化功能化的CNP在体内和体外都表现出强烈的结合能力，特别是对癌细胞表达相应受体的结合，显著提高了模型化疗药物的细胞毒性，使其能够更好地控制肿瘤生长并延长小鼠的存活时间。

　　随着过去十年来CNP的日益流行，对于定制其功能的需求不断增加。这项研究建立在CNP的遗传工程方面的最新进展之上。遗传操纵虽然强大，但每次制定新配方都需要大量时间和资源，无论之前是否有类似的配方。模块化功能化方法有助于简化流程。未来可以开发大量的模块化组件库，根据具体需求，可以轻松地将来自不同细胞膜源（如巨噬细胞、癌细胞、干细胞等）的表达SpyCatcher的CNP与各种功能性配体结合。与其他类型的CNP功能化方法相比，使用SpyCatcher系统也具有优势，因为锚点在工程化的细胞中固有地表达。因此，SC-NP在附着SpyTag标记的配体之前不必经过额外的处理或纯化，之后可以使用可扩展的过程，如横向流过滤，来去除未反应的成分。

　　尽管当前的研究侧重于癌症治疗，但该方法应容易推广到其他疾病条件或治疗模式。此外，除了使用SpyCatcher-SpyTag。