丝蛋白作为一种具有独特化学和物理特性的多功能生物材料，在各个应用领域中具有广泛的发展前景。其中，蜘蛛丝凭借其强韧的机械强度而备受关注。

　　重组生产是规模化生产蜘蛛丝最有希望的途径。然而，由于产物的宿主毒性特征和产量低下、蛋白质纯化困难等问题，针对于蜘蛛丝蛋白的规模化量产仍然困难重重。

　　该项研究中，研究人员通过改造巨大芽孢杆菌以分泌重组蜘蛛丝蛋白。该方法利用 Sec 途径进行生产，有效解决了宿主毒性和纯化困难的问题。并且研究证实，分泌信号序列的选择对于分泌起到至关重要的作用。最终数据显示，该方法在烧瓶培养物中的分泌滴度达到了约 100 mg/L。

　　近年以来，利用基因工程进行蜘蛛丝蛋白的重组生产已成为实现该物质工业规模生产的有力途径。该工作已在包括细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞、转基因植物和转基因动物等多种宿主生物体中取得了不同程度的成功。

　　尽管如此，实现重组蜘蛛丝的规模化生产仍是一个不小的难题。除此之外，在原核和真核宿主中表达重组蛛丝蛋白还存在质粒高度不稳定性、宿主毒性、蛛丝蛋白构建体的低溶解度以及转录和翻译错误等问题。

　　为解决上述问题，本次研究使用菌株均由巨大芽孢杆菌 MS941 亲本菌株构建，通过对其进行基因编辑以生产仿天然蛛丝蛋白的 A5 4mer 蛋白质。

　　研究者通过编辑将巨大芽孢杆菌构建体上的组氨酸标签从 N 末端移至 C 末端，以促进 Sec 途径的分泌功能。这是由于革兰氏阳性菌可以通过 Sec 分泌途径将重组蛋白直接分泌到培养基中，经证实，这种简洁的方法可以避免对底盘细胞进行更广泛的编辑。

　　这个新的 A5 4mer 基因被克隆到一组五个不同的巨大芽孢杆菌表达载体中，每个载体在 A5 4mer 基因开始之前都包含一个独特的分泌信号序列（SS），即 α-amy、LipA、NprM、Yoch 和 Yngk。这些序列此前被发现有助于在巨大芽孢杆菌中分泌重组纤维素酶。

　　初步培养结果发现，菌株 Yngk 和 Yoch 成功分泌丝蛋白。然而有趣的是，完全去除 SS 又会阻止宿主分泌丝。除此之外，数据表明在巨大芽孢杆菌中改变重组丝生产的翻译起始位点（TIS）不会对蛋白分泌产生影响，这与此前在其他革兰氏阳性宿主中分泌重组蛋白的发现相反。

　　在此之后，研究者针对反应条件进行了进一步优化。结果表明，在 37°C 的 M9 培养基中（在 LB 培养基基础上补充 1% w/v 葡萄糖作为碳源和能源），进一步添加谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸和蛋氨酸有助于缓解代谢瓶颈。

　　与 LB 或未添加氨基酸的 M9 培养基相比，重组丝蛋白分泌滴度增加了 135%，其分泌滴度在烧瓶中达到了 98.2±6.5 mg/L。与此同时，研究者发现该方法下产生的丝蛋白对宿主生物体的毒性降低，并且增强了宿主在基于葡萄糖的基本培养基中的性能。

　　关于下一步研究计划，研究团队指出将实施 RT-qPCR 和代谢流分析，从而准确了解芽孢杆菌宿主系统响应丝蛋白生产的变化。除此之外，这项工作的初步结果能够支持对于更大范围的 SS 和启动子强度的进一步研究，其将有助于破解串联翻译起始位点影响背后的机制。